El efecto colateral de la edición CRISPR-Cas9 en vivo

Dibujo20170602 Sequence alignment of guide RNA to actual off-target regions nmeth 4293

A finales de 2016, gracias a la edición genética CRISPR-Cas9, se logró restaurar la visión a ratones nacidos ciegos. Nature Methods publica un jarro de agua fría a esta terapia génica. Dos ratones tratados por esta técnica muestran múltiples efectos colaterales: más de 1500 mutaciones de un solo nucleótido, y más de 100 indels (lugares con trozos de ADN insertados o borrados). Todas estas mutaciones fortuitas están muy lejos del gen que fue tratado (llamado Pde6b), incluso en otros cromosomas, y no se observan en un ratón de control.

Lo más sorprendente es que las mutaciones observadas se encuentran en regiones del ADN que se parecen muy poco (no son homólogas) a la secuencia CRISPR que se usa de guía para la edición. Por ello, los programas bioinformáticos actuales son incapaces de predecir estos efectos colaterales. ¿Cómo es posible? ¿No nos aseguraron que la técnica CRISPR-Cas9 era segura? Muchos divulgadores españoles nos hemos puesto nerviosos con esta noticia. Si se confirman estos indicios, será un duro varapalo para el español que dirige el equipo que logró este avance, Juan Carlos Izpisua-Belmonte, aunque está emigrado en el Salk Institute (California, EE.UU.), e incluso para nuestro candidato oficial al Nobel por CRISPR, Francis J. M. Mojica, Universidad de Alicante (España).

Como siempre, futuros estudios tendrán que confirmar o desmentir este resultado. Si prefieres ir al grano, te recomiendo consultar tú mismo el trabajo de Steven Tsang, Alexander Bassuk, …, Diana G. Colgan, “Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo,” Nature Methods 14: 547–548 (30 May 2017), doi: 10.1038/nmeth.4293. Yo me enteré gracias a “La técnica CRISPR es capaz de crear cientos de mutaciones fortuitas”, Agencia SINC, 29 May 2017, que traduce (sin mención explícita) la nota de prensa “CRISPR Gene Editing Can Cause Hundreds of Unintended Mutations,” Columbia UMC, 30 May 2017; muchos medios en inglés han copiado dicha nota de prensa sin más. De hecho, el artículo no estaba disponible, ni siquiera en formato embargado, para su lectura por parte de los periodistas científicos cuando se publicaron estas noticias. Una pena (como conversé con Luis Quevedo en este hilo de Twitter).

[PS 05 Jun 2017] Recomiendo leer el artículo de Lluis Montoliu, “Biotecnología y post-verdad”, Biotecnología animal, 04 Jun 2017. Te extraigo lo más relevante: “Nosotros no hemos visto estas mutaciones en nuestros ratones editados con CRISPR. [Me] llevó algunas horas poder acceder al artículo [inicial] del que éste deriva, publicado en 2016, en el que los autores describían la generación de estos ratones editados con CRISPR, dentro de sus investigaciones en retinosis pigmentaria. [La] lectura atenta de los datos [me] sugiere que hay otras explicaciones alternativas. [Ellos] usan, para la obtención de sus ratones editados, unos reactivos CRISPR poco comunes. [Incluyen] en la mezcla microinyectada plásmidos, moléculas de [ADN] productoras de las guías necesarias que también contienen el gen de una variante de la nucleasa Cas9. [Un] exceso de producción de la nucleasa Cas9 bien podrían haber contribuido a la aparición de mutaciones inesperadas. [La] refutación definitiva de los datos y conclusiones publicadas en el artículo de Nature Methods llega de la mano de Gaetan Burgio, genetista de la ANU (Canberra, Australia). [La] mayoría, sino todas, las mutaciones observadas tienen poco, o nada, que ver con las herramientas CRISPR y sí mucho, o todo, que ver con la estrategia experimental usada y con el proceso analítico bioinformático erróneamente aplicado. [El] daño ya está hecho. [La] post-verdad ha llegado también a la Biotecnología. [/PS]

[PS 03 Jun 2017] El experto Lluis Montoliu‏ @LluisMontoliu nos comenta sobre los aparentes problemas para CRISPR-Cas9: “Hay que tener tranquilidad, pues hay lagunas en el nuevo trabajo; hay que tener paciencia. Ya hay datos anteriores que llegan a conclusiones opuestas tras un experimento CRISPR-Cas9 similar que se reportó en 2015; publicado en Nature Methods se concluyó que las posibles mutaciones causadas por CRISPR-Cas9 eran raras”. El artículo es Vivek Iyer, Bin Shen, …, William C Skarnes, “Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice,” Nature Methods 12: 479 (2015), doi: 10.1038/nmeth.3408.

Más aún, también nos recuerda que “la causa de las mutaciones observadas podría estar relacionada con la metodología usada para generar los ratones”, recomendando el artículo de Ian Haydon, “CRISPR controversy raises questions about gene-editing technique,” The Conversation, 31 May 2017, que destaca unos comentarios del propio Montoliu: “se usan métodos poco usuales y poco optimizados: un plásmido pX335 microinyectado que podría expresar más proteínas Cas9 de las necesarias, que podrían causar las mutaciones fortuitas observadas”. También se menciona que Gaetan Burgio @GaetanBurgio considera que hay muchos fenómenos que podrían explicar las mutaciones observadas sin recurrir a CRISPR-Cas9 como culpable. Parece claro que hay muchas más dudas entre los expertos sobre el nuevo trabajo de lo que yo pensé al releerlo por primera vez. [/PS]

Dibujo20170602 crispr cas9 in action Guillermo Freire Laura Lopez Encuentros con la Ciencia

Recuerda que Mojica descubrió un sistema de inmunidad adquirida en organismos procariotas basado en secuencias de ADN repetidas denominadas CRISPR (siglas de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, que se puede traducir por agrupaciones de repeticiones cortas palindrómicas regularmente interespaciadas). Hay unas proteínas asociadas a estas secuencias, llamadas Cas (siglas de CRISPR-associated, es decir, asociadas a secuencias CRISPR), entre las que destaca Cas9. Esta proteína se puede dirigir a un sitio concreto de un molécula de ADN para que realice un corte de la doble cadena (celeste en la figura); para ello se usa una molécula de ARN guía (sgRNA) que sirve de plantilla para la secuencia diana. El ARN guía contiene una secuencia de ARN transcrita a partir de una secuencia CRISPR (crARN), en azul en la figura, un espaciador, en rojo, y una molécula tracrRNA (transactivadora de crARN), en verde. Más información en la wikipedia.

Dibujo20170602 crispr-treated mice snv indel variants nmeth 4293

Se supone que la técnica de edición génica CRISPR-Cas9 basada en ARN guías es muy segura. Sin embargo, podría haber secuencias homólogas (muy parecidas) a la secuencia CRISPR que podrían verse afectadas por las proteínas Cas9, produciendo mutaciones no deseadas. Para encontrar dichos efectos colaterales se ha realizado una secuenciación del genoma completo (WGS) de dos ratones tratados con esta técnica. Como muestra esta tabla, el ratón F03 muestra 164 indels (acrónimo de inserción-deleción) y 1736 SNVs (siglas de variaciones de un único nucleótido), de las cuales 63 y 885 están asociadas a genes conocidos; para el ratón F05 se observan 128 indels y 1696 SNVs, 51 y 865 asociados a genes conocidos. La última columna indica que 117 indels y 1397 SNVs son comunes a ambos ratones.

Más aún, la comparación entre las mutaciones observadas en los ratones tratados y todos los genomas secuenciados en el MGP (Mouse Genome Project) sugiere que se trata de nuevas mutaciones no observadas hasta ahora. Por ello los autores del estudio afirman que son provocadas por la técnica de edición CRISPR-Cas9. Más aún, las que están relacionadas con genes podrían inducir cambios perniciosos en el fenotipo. Según los autores, las técnicas actuales de predicción in silico (mediante análisis bioinformático) de las posibles consecuencias de la edición CRISPR-Cas9 son incapaces de predecir las mutaciones observadas. La razón es que la homología (o parecido) entre las secuencias con mutaciones y la secuencia del ARN guía es muy pobre.

Por ahora los ratones tratados que muestran estas mutaciones parecen comportarse con total normalidad. Quizás los efectos de dichas mutaciones aparezcan en un futuro no muy lejano. Aún así, los autores del estudio en Nature Methods consideran que hay que tener mucha precaución con la técnica de edición génica CRISPR-Cas9, ya que podría ser mucho menos segura de lo que afirman sus defensores.

No soy experto, así que no sé si debería permitirme el lujo de ofrecer mi opinión sobre este trabajo. El artículo en Nature Methods tiene una estadística muy pobre y me parece que su metodología presenta muchas lagunas. No sé si se puede descartar que el resultado sea un artefacto del protocolo experimental usado. Creo que debemos estar tranquilos hasta que estos resultados sean confirmados (o refutados) por futuros estudios (tanto in vivo como in vitro).


19 Comentarios

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benjaminbenjamin

Hola Francis se que no eres experto en lo que voy a preguntar, pero igual pregunto porque eres muy inteligente y sabes de todo

http://www.cell.com/cell/fulltext/S0...(17)30538-X

dos preguntas sobre ese paper de arriba
1) es el primer caso que se conoce en detalle un “algoritmo” cerebral?
2) es posible usar este algoritmo a un programa o red neuronal o aprendizaje profundo para deteccion de caras?

Francisco R. Villatoro

Benjamin, no soy experto. (1) El concepto de “brain’s code”, que no es lo mismo que “algoritmo cerebral”, se lleva usando desde principios de los 1990 y hay cientos de trabajos publicados con “códigos” a diferente nivel de detalle, la mayoría en animales, aunque desde 2012 también con humanos. (2) Supongo que será posible, pero no lo sé; aún así recuerda que los algoritmos actuales de detección de caras mediante aprendizaje profundo funcionan perfectamente bien sin necesidad de “imitar” cualquier posible “código encefálico” usado por los humanos; de hecho, no sabemos cómo funcionan y muchos expertos creen que desvelarlo ayudará a saber cómo los humanos reconocemos caras.

benjaminbenjamin

Francis
cual es la diferencia entre codigo del cerebro y algoritmos del cerebro?

Ya conocemos algun algoritmo del cerebro?

AlbertoAlberto

No estaría mal la opinión de un gran experto sobre el tema. Por ejemplo la del mismísimo Mojica.

Enrique VigueraEnrique Viguera

Esto comenta el
experto Lluis Montoliu “Las mutaciones que reporta el artículo #CRISPR en Nat.Methods podrían haber sido causadas por los reactivos usados para generar los ratones”

AgubermAguberm

Esto no me tiene sentido, pq esos mismos reactivos deberían haberse usado tb en los ratones control.

Alvaro VerdiónAlvaro Verdión

A ver, dos ratones te dan para reexaminar el tema pero no para sacar conclusiones. Lo mismo es una anomalía estadística y ya estadística.

pochimaxpochimax

También es muy importante saber qué producen esas mutaciones y deleciones. Si se producen mayoritariamente en regiones no codificantes o sin utilidad aparente, de manera que no generan efectos secundarios importantes, a lo mejor sigue mereciendo la pena como tratamiento. Todos los medicamentos tienen efectos secundarios, hay que ponderar pros y cons.

De todas formas, lo importante del artículo es que recomienda en los experimentos emplear secuenciación genómica completa de todo el código genético, para comprobar lo que realmente ocurre y no lo que se venía haciendo hasta ahora que debía ser estudiar solo las zonas donde se predecían errores…

AlbertoAlberto

Esperemos que pronto tengamos mas noticias sobre el experimento. Todos tenemos puestas grandes esperanzas en CRISPR. Yo soy optimista y de confirmarse los resultados seguro que al final se conseguirá mejorar la técnica y evitar los efectos colaterales.

JoseJose

Sinceramente, a mi me parece que en todos los ámbitos de la investigación hay mucha “mala baba”, o como lo queráis llamar.

JoseJose

Hola Francis. Lo que tu llamas post_verdad yo lo llamo “mala baba”. Quizás soy un poco conspiranoico pero el mundo anglosajón parece no llevar muy bien que también se consigan grandes avances científicos fuera de su mundo. Al menor indicio, aunque sea con estudios sesgados, de que algo va mal se lanzan a la yugular. Saludos

AlbertoAlberto

Uno de los grandes problemas a los que se enfrenta CRISPR es a la ingente cantidad de dinero que puede mover en un futuro cercano. Eso puede desestabilizar muchas cosas.

AlbertoAlberto

De momento podemos comprar hoy acciones de compañías relacionadas con CRISPR desde un 5% a un 12% mas baratas que hace una semana.

DavidDavid

Esperemos que haya suerte.
Definitivamente, si CRISPR/CAS9 llega a convertirse en una tecnología consolidada/internacionalmente adoptada, probablemente sea uno de los mayores (si no el mayor) avances científicos de este siglo.

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