Vídeo de CRISPR-Cas9 en acción

Dibujo20171114 HS-AFM observations of the release of the cleavage products nature s41467-017-01466-8

Usando un microscopio de fuerza atómica de alta velocidad (HS-AFM) se puede visualizar en tiempo real a las tijeras CRISPR-Cas9 en acción. La endonucleasa Cas9 se liga a una secuencia de ARN guía, asociada a una secuencia CRISPR, y corta la doble cadena de ADN en la secuencia complementaria a dicho ARN guía. Observar en tiempo real su acción es realmente alucinante. Todo un lujo para los expertos y todo un placer para los aficionados.

La microscopia HS-AFM (High-Speed Atomic-Force Microscopy) permite visualizar en tiempo real la acción de muchas macromoléculas. Lo más interesante son los cambios conformacionales de la molécula de gran importancia en la flexibilidad y fiabilidad de las proteínas Cas9. Los resultados son coherentes con los estudios biofísicos previos, basados en simulaciones por ordenador. Los vídeos muestran cómo cambia la conformación de la proteína cuando se liga al ARN guía (gRNA), cómo busca la secuencia complementaria y cómo se activa la nucleasa que realiza el corte.

El artículo es Mikihiro Shibata, Hiroshi Nishimasu, …, Osamu Nureki, “Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy,” Nature Communications 8: 1430 (2017), doi:10.1038/s41467-017-01466-8. Para una descripción detallada de los vídeos recomiendo la información suplementaria específica [PDF].

[PS 17 Nov 2017] Más información divulgativa en Sarah Zhang, “An Astonishing Video Shows CRISPR Editing DNA in Real Time,” The Atlantic, 13 Nov 2017. [/PS]

Te recomiendo pausar el vídeo para ir viendo con todo lujo de detalles la acción. Por cierto, te recuerdo que el sistema inmune microbiano CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-associated protein) permite a la bacteria defenderse cortando el ADN del virus invasor usando la secuencia CRISPR como guía. Para observar usando HS-AFM la acción de estas tijeras moleculares se colocan sobre un sustrato de mica tratado con 3-aminopropiltrietixisilano (AP-mica).

Dibujo20171114 Structural rearrangement of the HNH domain CRISPR-Cas9 HS-AFM nature s41467-017-01466-8

Para interpretar las imágenes de los vídeos se han usado las estructura cristalinas tridimensionales disponibles (tanto de la proteína Cas9 aislada, como ligada al ARN guía, como además ligada a la cadena de ADN a cortar). La endonucleasa Cas9 tiene una forma bilobulada, por un lado el lóbulo de acción nucleasa NUC y el lóbulo de reconocimiento REC. El lóbulo NUC tiene cuatro dominios: los dominios nucleasa HNH y RuvC, creadores del doble corte en la cadena diana del ADN, el dominio PI, que interacciona con la secuencia PAM (motivo adyacente al protoespaciador), y el dominio de cuña WED; la secuencia PAM tiene entre tres y cinco nucleótidos, varía entre especies, siendo fundamental para el reconocimiento de la diana por la endonucleasa. El lóbulo REC está diferenciado en tres dominios, REC1, REC2 y BH (hélice puente).

Dibujo20171114 CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy nature s41467-017-01466-8

Los cambios de brillo en la proteína Cas9 corresponden a los cambios de conformación en sus dominios (p. ej. el dominio HNH tiene dos estados que sobresalen de la enzima con una diferencia en altura de 0,8 ± 0,2 nm). Como puedes observar todo el proceso de corte tiene una duración de unos 100 segundos. Lo más relevante de los vídeos es que muestra que la conformación del dominio HNH fluctúa mucho más de lo que se pensaba; futuros estudios mediante simulaciones por ordenador tendrán que desvelar los detalles íntimos.

Dibujo20171114 model crispr-cas9 action nature s41467-017-01466-8

Por desgracia mis conocimientos en estas lides son insuficientes para relatar en detalle todo el proceso de corte mostrado en los vídeos. Me limito a mostrar este esquema que aparece en el artículo reseñado. Para los legos los vídeos pueden parecer “oscuros, incomprensibles, sosos, irrelevantes… ¡Pero son la releche!” (como exclama César Tomé en Twitter).


7 Comentarios

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benjaminbenjamin

Hola Francis

Con el XFEL no se podría ver lo mismo cas9 e tiempo real pero a una escala atómica y en vivo?

VíctorVíctor

Me ha gustado mucho ver este trabajo destacado en tu blog, el cual sigo periodicamente. Conozco bien a Mikihiro Shibata. Compartimos lab durante 3 años, hace 10 años. Hace unos 15 meses me enseñó los videos cuando coincidimos en unas charlas. Estaba seguro que lo podría publicar en Nature. No ha sido así.

Alb.Alb.

Yo tampoco entiendo casi nada…. pero me sorprende que sea tan lento: 100 segundos me parece mucho tiempo.
Aunque tampoco tengo claro que es lo que esta haciendo en esos 100segundos

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